近年來越來越多的重組蛋白（特別是人源化單克隆抗體）作為生物藥應(yīng)用于醫(yī)療。臨床及實(shí)驗(yàn)室研究中，經(jīng)常要求在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)一定量的重組蛋白。AtaGenix上周介紹的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株生產(chǎn)重組蛋白過程繁瑣，周期太長(zhǎng)。作為其替代方法，瞬時(shí)基因表達(dá)技術(shù)則能在數(shù)周內(nèi)生產(chǎn)數(shù)十甚至數(shù)百毫克重組蛋白，因而得到廣泛應(yīng)用。

那么，

它是如何做到的呢？

接下來AtaGenix將帶您了解這項(xiàng)快速獲取真核重組蛋白的神技——哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)（Transient Gene Expression，TGE）。

AtaGenix技術(shù)人員正在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)的奧妙主要集中在宿主細(xì)胞系、表達(dá)載體的最優(yōu)化設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)染條件的選擇三個(gè)方面。

宿主細(xì)胞系

哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于其翻譯后修飾能力，如糖基化、磷酸化和二硫鍵正確折疊等，可使重組蛋白形成正確結(jié)構(gòu)從而具有生物活性。瞬時(shí)表達(dá)中最常用的哺乳細(xì)胞是HEK293和CHO細(xì)胞及兩者的亞系。

 

HEK293細(xì)胞

HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)于靜止培養(yǎng)基時(shí)中度貼壁,每30 h傳一代，最高生長(zhǎng)密度可達(dá)2-5×10⁶ cells/mL。它易于懸浮適應(yīng)、無(wú)血清馴化。因其改造自人源細(xì)胞，表達(dá)人源重組蛋白藥物時(shí)不會(huì)引起免疫反應(yīng)，是TGE 中最常用的細(xì)胞系。有研究指出，HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果可用于預(yù)測(cè)重組蛋白在CHO細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的水平和質(zhì)量。

 

CHO細(xì)胞

CHO細(xì)胞是最早建立的體外培養(yǎng)細(xì)胞系之一，作為生產(chǎn)藥物蛋白的宿主細(xì)胞，它一直備受青睞。 到2012年為止，在美國(guó)及歐洲市場(chǎng)上 的28個(gè)抗體藥物中有12個(gè)來自CHO細(xì)胞。CHO細(xì)胞本身粘附性強(qiáng)，需進(jìn)行懸浮適應(yīng)和無(wú)血清馴化，傳代時(shí)間為18 h，細(xì)胞生長(zhǎng)密度可達(dá)5×10⁶-1×10⁷ cells/mL。雖然有報(bào)道稱其糖基化方式與人體細(xì)胞略微不同，但鑒于CHO細(xì)胞在藥物蛋白穩(wěn)定生產(chǎn)方面的良好表現(xiàn)，工業(yè)上更傾向于在TGE工藝中使用CHO細(xì)胞家族。用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)的CHO細(xì)胞都是CHO K1細(xì)胞系的子代細(xì)胞或DG44和DUK X B11的dhfr陰性變種，適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的CHO-S細(xì)胞由CHO K1細(xì)胞衍生而來。

 

HEK293及 CHO細(xì)胞的改造亞系

早期研究發(fā)現(xiàn)，猴病毒40(SV40)和埃巴病毒(EBV)能維持其宿主細(xì)胞周質(zhì)中的游離質(zhì)?？截悢?shù)，并通過特有的病毒特性加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯。對(duì)SV40來說，這種效果是由SV40大T抗原與其復(fù)制起點(diǎn) SV40 ori 結(jié)合引起的。而源于EBV病毒的EBNA-1蛋白和oriP的結(jié)合以及小鼠多形瘤病毒大 T抗原與多形瘤復(fù)制起點(diǎn)Pyori的結(jié)合也起到類似的作用?；谶@些發(fā)現(xiàn)，用建立穩(wěn)定細(xì)胞系的方法對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行改造，先后得了HEK293-T、HEK293-EBNA和293-6e以及CHO EBNA1c-3E7、CHO EBNALT和Expi-CHO等細(xì)胞亞系，分別可穩(wěn)定表達(dá)EBNA-1、SV4大T抗原或小鼠多形瘤病毒T抗原。當(dāng)轉(zhuǎn)入的載體中攜有能與這些蛋白相結(jié)合的復(fù)制起點(diǎn)時(shí)，游離態(tài)質(zhì)粒的拷貝數(shù)將得以增加并維持，進(jìn)而加強(qiáng)表達(dá)。

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HEK293和CHO

無(wú)血清懸浮細(xì)胞系，

各三種，

盡在AtaGenix,

供您選擇~

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表達(dá)載體的最優(yōu)化設(shè)計(jì)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因表達(dá)受一系列事件影響，包括轉(zhuǎn)錄RNA加工、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)及降解、翻譯、翻譯后修飾及分泌(對(duì)于分泌蛋白)。設(shè)計(jì)載體時(shí)可通過添加及組合各種調(diào)控元件影響這些事件，使TGE蛋白表達(dá)最優(yōu)化。

比如

AtaGenix

自主研發(fā)優(yōu)化的

pATX1和pATX2載體，

不但具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，

而且表達(dá)效率高。

用事實(shí)說話

案例1-蛋白H在pATX1的表達(dá)

AtaGenix比較了pATX1和商業(yè)化pcDNA3.1對(duì)蛋白H的表達(dá)，結(jié)果顯示蛋白在pcDNA3.1無(wú)表達(dá)，而在pATX1上表達(dá)成功，表達(dá)量為4.53 mg/L(純化后)。

蛋白H 在不同載體上的表達(dá)

蛋白H 的純化測(cè)試

蛋白H 的酶切

案例2-蛋白L在pATX2的表達(dá)

蛋白L存在兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，理論分子量為47.1 kDa。在pATX2上表達(dá)成功，表達(dá)后蛋白L實(shí)際分子量約為55 kDa，表達(dá)量為247.5 mg/L(純化后)。

蛋白L 的表達(dá)

蛋白L 的純化測(cè)試

蛋白L 的質(zhì)量控制

轉(zhuǎn)染條件的摸索

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是TGE工藝非常關(guān)鍵的步驟，轉(zhuǎn)染效率一定程度上決定了重組蛋白的表達(dá)水平。常用的轉(zhuǎn)染試劑包括脂質(zhì)體、磷酸鈣及聚乙烯酰胺(PEI)，可用于懸浮或貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，具有轉(zhuǎn)化效率高，細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)。脂質(zhì)體價(jià)格昂貴不適合應(yīng)用于轉(zhuǎn)染規(guī)模通常在數(shù)百毫升以上的TGE工藝。磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染應(yīng)用較早，是除PEI外在大規(guī)模瞬時(shí)表達(dá)中應(yīng)用最多的轉(zhuǎn)染試劑，但磷酸鈣會(huì)與懸浮培養(yǎng)基中防止細(xì)胞聚集的成分形成沉淀物，在轉(zhuǎn)染前需要有換液過程，不適合大規(guī)模瞬時(shí)表達(dá)。

  因此，

我們只重點(diǎn)介紹

PEI介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模TGE的成功一定程度上可歸功于陽(yáng)離子聚合物PEI的出現(xiàn)。PEI最早在基因治療實(shí)驗(yàn)中作為DNA載體，工業(yè)上可大量生產(chǎn)，價(jià)格便宜，其中應(yīng)用最普遍的是線性25 kDa PEI。

主要影響因素

影響PEI介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率的因素主要包括DNA用量、DNA與PEI質(zhì)量比以及轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度。DNA的最佳用量通常在1μg/10⁶ cells，其表達(dá)質(zhì)粒用量極大，成為大規(guī)模TGE的主要成本之一。越來越多證據(jù)表明，用一定比例的填充DNA（如蜥蜴精子中的DNA）代替實(shí)際表達(dá)質(zhì)粒并不會(huì)降低重組蛋白表達(dá)，同時(shí)可節(jié)省表達(dá)質(zhì)粒用量。DNA與PEI的質(zhì)量比應(yīng)在1：2-1：3左右，太低影響轉(zhuǎn)染效率，過高則可能造成較高的細(xì)胞毒性。轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到 1-2×10⁶ cells/mL，而懸浮培養(yǎng)的HEK293和CHO細(xì)胞多生長(zhǎng)在0.5-2×10⁶ cells/mL密度，轉(zhuǎn)染前需經(jīng)離心或沉降使細(xì)胞濃縮至合適密度。

其他因素

其他因素如DNA與PEI的混合孵育時(shí)間、轉(zhuǎn)染試劑占總體積比曾被認(rèn)為極為重要，但最近的研究表明直接按順序加入DNA、PEI到細(xì)胞中，也得到類似的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)量。此外某些商業(yè)化培養(yǎng)基中用以減少細(xì)胞聚集的葡萄糖硫酸酯以及用于替代轉(zhuǎn)鐵蛋白的檸檬酸鐵都會(huì)阻礙PEI介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染?？傮w上看，PEI介導(dǎo)HEK293細(xì)胞系瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率約為60%，而介導(dǎo)CHO細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染則相對(duì)困難。

AtaGenix主要采用

自己研發(fā)和優(yōu)化的

PEI

及

商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑。

PEI用于大規(guī)模生產(chǎn)。

下面是Atagenix采用優(yōu)化的PEI轉(zhuǎn)染試劑表達(dá)人源化單克隆抗體mAbA3實(shí)例，表達(dá)量為103 mg/L。

mAbA3 的表達(dá)純化

mAbA3 的質(zhì)量控制

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怎么樣，

如此豐富的案例，

有沒有讓你心動(dòng)？

其實(shí)，

成為蛋白表達(dá)服務(wù)業(yè)的權(quán)威，

一直是普健生物的奮斗目標(biāo)。

因此，

我們從不放棄探索與研究。

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更多蛋白表達(dá)，

盡在AtaGenix。