記得讀研究生時(shí),
實(shí)驗(yàn)室的規(guī)矩之一
就是新手要負(fù)責(zé)制備公用的感受態(tài)細(xì)胞,
即使有師兄師姐帶著做,
結(jié)果仍然被鄙視。
心里不免產(chǎn)生一個(gè)疑問,
同樣的protocol,
為啥我做的感受態(tài)就是不行?
作為新手的我們,
要想制備一款敏感卻不脆弱的感受態(tài),
得先了解
感受態(tài)細(xì)胞是什么
↓
理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞,使其處于容易吸收外源DNA的生理狀態(tài),這種細(xì)胞即為感受態(tài)細(xì)胞。
目前制備感受態(tài)細(xì)胞常用的方法有RbCl (KCl)法、CaCl2法、電擊感受態(tài)法等。其中,RbCl (KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高,但制備較復(fù)雜,不適合實(shí)驗(yàn)室用;CaCl2法簡(jiǎn)便易行,且轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)要求,使用廣泛;電擊感受態(tài)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高,操作簡(jiǎn)單,需要電擊儀進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化工作。因此實(shí)驗(yàn)室感受態(tài)制備常用的兩種方法就是CaCl2法和電擊法。
實(shí)驗(yàn)室常用的有大腸桿菌、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞,具體制備方法如下所示:
1. 挑取宿主菌單菌落接種于3-5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12 h左右,直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)2-3 h至OD600在0.4-0.6之間。
2. 將培養(yǎng)液置于冰上放置30 min,然后于4 ℃下4000 r/min離心10 min,收菌。
3. 按3 mL菌液/1 mL的CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置30 min后,4 ℃下4000 r/min離心5 min,棄去上清。
4. 加入700 μL的CaCl2輕輕懸浮細(xì)胞,加入300 μL的甘油混合均勻,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。
5. 感受態(tài)細(xì)胞分裝成100 μL的小份,貯存于-80 ℃可保存半年。
1. 從-80 ℃超低溫冰箱中取出保存于甘油管中的畢赤酵母GS115或X-33,在YPD平板上劃線,30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3天。
2. 挑取單菌落,接種在5 mL YPD液體培養(yǎng)基中,于28 ℃振蕩培養(yǎng)18-24 h。
3. 取80-120 μL過夜培養(yǎng)物,接種到100 mL液體YPD培養(yǎng)基中,過夜生長(zhǎng)至OD600 =1.15-1.5之間(最好是1.3),將細(xì)胞置4 ℃或冰上放置10 min。
4. 4 ℃下在2000 g離心5 min,收集細(xì)胞。加入100 mL冰冷的無菌水輕輕使菌體懸浮,再按上步離心。
5. 加入50 mL冰冷的無菌水懸浮清洗,兩管合并到一管,再按上步離心,棄上清。
6. 細(xì)胞懸浮于40 mL 1 M冰冷的山梨醇,依上步離心后,再懸浮于20 mL 1 M冰冷的山梨醇,按上步離心,去上清。
7. 用大約100-200 μL的1 M冰冷的山梨醇重懸細(xì)胞,使細(xì)胞終濃度達(dá)到1×1010 cells/mL,放置在冰上備用(僅當(dāng)天使用)(一般先加100 μL重懸,若細(xì)胞比較粘稠吸附不起來,再適當(dāng)加50-100 μL)。
1. 挑取宿主菌接種于3 mL 液體培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)過夜。
2. 從過夜培養(yǎng)物中取100 μL菌液,接種至用50 mL 離心管配好的5 mL SPI Medium中,37℃搖床培養(yǎng),3 h后開始測(cè)OD600,當(dāng)培養(yǎng)物生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)末期時(shí)約4.5 h,快速取200 μL接種到2 mL SP II Medium中,于37℃ 100 rpm搖床培養(yǎng)1.5 h。
3. 加20 μL 100×EGTA溶液,于37℃ 100 rpm搖床培養(yǎng)10 min,用1.5 mL離心管分裝成500 μL每管。
4. 向管中加入適量的質(zhì)粒,輕輕混勻于37℃ 100 rpm搖床培養(yǎng)30 min。
5. 將離心管轉(zhuǎn)移到250 rpm搖床,37℃培養(yǎng)1.5 h。
6. 以4000 rpm離心收集菌體,棄部分上清液,留100 μL重懸菌體,涂相應(yīng)的選擇性平板,37℃過夜培養(yǎng)。
1. 挑取宿主菌單菌落至10 mL枯草芽孢桿菌基本培養(yǎng)基中,37℃ 劇烈振蕩培養(yǎng)16~18 h,250 r/min,培養(yǎng)至OD600為1.0。
2. 取1.5 mL該培養(yǎng)液加入到10 mL 37℃ 水浴預(yù)熱的40 mL新鮮枯草芽孢桿菌基本培養(yǎng)基中,37℃劇烈振蕩培養(yǎng)4 h,250 r/min。
3. 加入 10 mL芽孢桿菌饑餓培養(yǎng)基,37℃劇烈振蕩培養(yǎng)4 h,250 r/min。
4. 將細(xì)菌在冰水浴冷卻15 min,分裝于0.5 mL Eppendorf 管中,于4℃ 10000 r/min 離心10 min,用預(yù)冷的水輕輕溶解懸浮,可直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn),也可于-80℃凍存。
看起來protocol都很簡(jiǎn)單,
但制備的感受態(tài)效果卻千差萬別,
原因可能就是你沒有注意到一些實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。
↓
注意事項(xiàng)01細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度:細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為宜,可通過檢測(cè)培養(yǎng)液的OD600來控制,如DH5α菌株的細(xì)胞密度在5×107個(gè)/mL左右就比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。
02實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要格外小心:懸浮細(xì)胞時(shí)要輕柔,以免造成菌體破裂,影響轉(zhuǎn)化效率。
03制備好的感受態(tài)最好一次分裝后快速冷凍于-80℃,反復(fù)凍融會(huì)極大地影響轉(zhuǎn)化效率。
從離心機(jī)拿出離心管時(shí)應(yīng)立即插入冰中,再拿到超凈臺(tái),操作時(shí)不要用手觸摸管底的菌體沉淀并保持無菌操作。
05離心機(jī)和離心管要提前半小時(shí)預(yù)冷。
06整個(gè)制備過程不要染菌,制備結(jié)束后,可在相應(yīng)的平板上涂一支感受態(tài)細(xì)胞,檢測(cè)其是否染菌。
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