Biacore系統(tǒng)

Biacore是基于表面等離子體共振（SPR）技術(shù)來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤生物分子間的相互作用，而不用任何標(biāo)記物的技術(shù)，是被公認(rèn)的檢測(cè)分子互作的金標(biāo)準(zhǔn)。

表面等離子體子共振( surface plasmon resonance , SPR) 是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。在發(fā)生全反射的界面涂上一薄層金膜（或其它金屬膜）約50nm厚。一束P偏振光在一定的角度范圍內(nèi)入射到棱鏡端面，在棱鏡與金屬薄膜（Au或Ag）的界面將產(chǎn)生表面等離子波。當(dāng)入射光波的傳播常數(shù)與表面等離子波的傳播常數(shù)相匹配時(shí)，引起金屬膜內(nèi)自由電子產(chǎn)生共振，即表面等離子體共振。

分析時(shí)，先將配體（抗體、蛋白等分子）偶聯(lián)再芯片表面，然后將待測(cè)樣品（分析物）流過(guò)芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子相互作用的分子，會(huì)引起金膜表面折射率變化，最終導(dǎo)致SPR角變化，通過(guò)監(jiān)測(cè)SPR的角度變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動(dòng)力學(xué)常數(shù)和特異性等，如下圖所示實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的生物分子動(dòng)態(tài)結(jié)合和解離的過(guò)程。

Biacore系統(tǒng)的應(yīng)用

Biacore系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于蛋白-蛋白、蛋白-小肽、蛋白-DNA，蛋白-藥物、小肽-噬菌體、SPR-MS等各種生物分子之間相互作用。其應(yīng)用領(lǐng)域包含生命科學(xué)、食品安全、環(huán)境檢測(cè)、生物醫(yī)學(xué)、毒素和抗生素快速檢測(cè)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物篩選及相關(guān)藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)檢測(cè)、生物分子特殊肽段及相關(guān)偶合分子的檢測(cè)、病毒及致病分子/蛋白及受體研究、分子識(shí)別、免疫調(diào)節(jié)、免疫測(cè)定等，尤其適于在高校、科研院所進(jìn)行科學(xué)研究及教學(xué)實(shí)驗(yàn)使用。

探索之旅開(kāi)始Biacore系統(tǒng)生物分子相互作用的應(yīng)用第1站

動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

傳統(tǒng)用于鑒定生物大分子間相互作用的技術(shù)有WB、Elisa、Co-IP、ChIP、EMSA、FRET、酵母雙雜交等。具體實(shí)驗(yàn)中這些技術(shù)常因目的蛋白表達(dá)量低、抗體靈敏度低等原因而檢測(cè)不出目的條帶，或者因?yàn)榭贵w的特異性不好，而無(wú)法判斷抗體是否與目的蛋白有結(jié)合，同時(shí)也極易出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性的結(jié)果。

Biacore通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)合在芯片表面分子質(zhì)量的變化，可以得到兩個(gè)分子之間的結(jié)合與解離常數(shù)，直觀反應(yīng)生物大分子之間的親和力。由于檢測(cè)的是芯片表面質(zhì)量的變化，所以大分子的相互結(jié)合容易得到較強(qiáng)的信號(hào)。Biacore可以用來(lái)分析不同抗體與抗原、蛋白與小分子的結(jié)合與解離常數(shù)，相對(duì)與以前其它檢測(cè)抗體效價(jià)的方法，Biacore不僅快速，可以準(zhǔn)確定量，還能反應(yīng)整個(gè)結(jié)合和解離的動(dòng)態(tài)過(guò)程。

第2站

蛋白構(gòu)效與生理功能調(diào)控的研究

Hirano等利用Biacore技術(shù)分析得出，SLR1 G576V位點(diǎn)突變導(dǎo)致其與GID1結(jié)合的解離速度加快，SLR1-GID1穩(wěn)定性下降，SLR1自發(fā)性降解減弱，SLR1蛋白抑制GA信號(hào)傳導(dǎo)，從而出現(xiàn)水稻矮化表型。Magulies等利用Biacore技術(shù)研究MHC、TCR與多肽抗原三者的相互作用。他們?cè)跍y(cè)定了三者相互作用的親和常數(shù)及動(dòng)力學(xué)參數(shù)后提出一個(gè)相當(dāng)有說(shuō)服力的生物學(xué)模型：即T細(xì)胞的激活依賴(lài)于抗原遞呈細(xì)胞表面大量的抗原多肽-MHC復(fù)合物對(duì)單個(gè)T細(xì)胞表面大量TCR的刺激。

第3站

疾病標(biāo)志物的診斷

對(duì)于疾病研究，生物標(biāo)志物一般是指可供客觀測(cè)定和評(píng)價(jià)的一個(gè)普通生理或病理或治療過(guò)程中的某種特征性的生化指標(biāo)，通過(guò)對(duì)它的測(cè)定可以獲知機(jī)體當(dāng)前所處的生物學(xué)過(guò)程中的進(jìn)程。檢查一種疾病特異性的生物標(biāo)志物，對(duì)于疾病的鑒定、早期診斷及預(yù)防、治療過(guò)程中的監(jiān)控可能起到幫助作用。目前常用于標(biāo)志物診斷的方法有分子診斷、免疫分析、生化酶法等。

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法其診斷試劑的開(kāi)發(fā)往往存在活性低、穩(wěn)定性差、靈敏度低等方面的問(wèn)題，利用Biacore技術(shù)建立全新的診斷體系無(wú)疑是一個(gè)創(chuàng)新性的選擇。通過(guò)標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測(cè)定樣品中標(biāo)志物濃度，可達(dá)到靈敏度高、穩(wěn)定等效果。

第4站

診斷抗體篩選

在科學(xué)研究中往往會(huì)遇到發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的診斷標(biāo)志物，針對(duì)該新標(biāo)志物或成熟的標(biāo)志物開(kāi)發(fā)診斷用單克隆抗體時(shí)，因該標(biāo)志物表達(dá)量較低，開(kāi)發(fā)的單抗靈敏度不夠而檢測(cè)不到，只能檢測(cè)外源過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株。此時(shí)，利用外源表達(dá)標(biāo)志物蛋白，進(jìn)行單克隆制備，并通過(guò)Biacore篩選高親和力的單抗，可解決靈敏度低的問(wèn)題，為診斷試劑開(kāi)發(fā)提供高效的篩選平臺(tái)。

第5站

垂釣法-未知互作因子的發(fā)現(xiàn)與藥物新靶點(diǎn)或有效成分的鑒定

在蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域，經(jīng)常需要通過(guò)一個(gè)已知的蛋白尋找與之互作的未知因子，從而發(fā)現(xiàn)整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；在中藥等天然產(chǎn)物研究中，最核心的就是鑒定其有效的單體成分。

基于SPR-MS的垂釣技術(shù)能在分子水平上發(fā)現(xiàn)和鑒定新的互作因子，通過(guò)將“誘餌分子”固定在芯片表面，當(dāng)被檢測(cè)樣品流過(guò)芯片表面時(shí)，未知的互作因子能夠與“誘餌分子”相結(jié)合, 實(shí)現(xiàn)對(duì)未知相互作用因子的俘獲，再自動(dòng)化回收這些互作因子，并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定出未知因子結(jié)構(gòu)。第二軍醫(yī)大學(xué)張俊平教授課題組以腫瘤壞死因子受體（TNFR）為“誘餌蛋白”，采用Biacore垂釣技術(shù)進(jìn)行了5種中藥的篩選和分離，儀器可以自動(dòng)化地完成樣品進(jìn)樣、結(jié)合、洗滌、孵育、解離、回收、中和等垂釣實(shí)驗(yàn)的全部過(guò)程，最終從大黃中分離回收得到了TNFR的配體。

第6站

新藥創(chuàng)制-貫穿從藥物篩選到生產(chǎn)質(zhì)控

“新藥創(chuàng)制”已被列入“十三五”國(guó)家科技創(chuàng)新規(guī)劃，國(guó)家對(duì)于藥物研發(fā)的重視程度已上升到戰(zhàn)略層面?！靶滤巹?chuàng)制”不但成為提升行業(yè)和企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的重要手段，更成為改善人民群眾生活質(zhì)量，滿(mǎn)足重大疾病和突發(fā)疫情防治需求的重要保障。Biacore技術(shù)作為全球范圍新藥研究、篩選、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)控的不可或缺的技術(shù)，已被2016版美國(guó)藥典（USP39）和日本藥典（JP17）正式收錄。

參考文獻(xiàn)

1.  Biacore 8K頻上央視新聞的“秘密武器”，GE Healthcare.

2.  Easy Biacore | 垂釣實(shí)驗(yàn)SOP來(lái)襲！GE Healthcare.

3.  Biacore Training. GE Healthcare.

4.  Hirano et al., 2010, The Plant Cell, Characterization of the Molecular Mechanism Underlying Gibberellin Perception Complex Formation in Rice.

5.  Magulies et al., 1994, Science, T Cell Receptor-MHC Class I Peptide Interactions: Affinity, Kinetics, and Specificity.

6.  Cao et al., 2016, Anal Bioanal Chem, Identification of a ligand for tumor necrosis factor receptor from Chinese herbs by combination of surface plasmon resonance biosensor and UPLC-MS.

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