近年來，人類在治療埃博拉病毒感染的病人時發(fā)現(xiàn)，抗埃博拉病毒的單克隆抗體在治療的過程中起著關(guān)鍵作用?？茖W(xué)家認(rèn)為，快速有效地開發(fā)具有生物反應(yīng)活性的單克隆抗體的技術(shù)對于治療和控制人類面臨的各類傳染性疾病至關(guān)重要。

上個世紀(jì)90年代，人們就已經(jīng)開始利用DNA免疫技術(shù)開發(fā)新型疫苗。DNA疫苗的基本原理：肌肉注射人工合成包含有病毒DNA的質(zhì)粒載體，質(zhì)粒在體內(nèi)進(jìn)行基因表達(dá)并合成對應(yīng)的蛋白抗原，從而引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。這種疫苗最顯著的特點(diǎn)是通過內(nèi)源抗原提呈途徑刺激T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，基于該原理開發(fā)的DNA疫苗卻遇到了問題，例如如何選擇合適的免疫途徑和免疫佐劑。早期臨床研究數(shù)據(jù)表明，通過DNA疫苗免疫的患者血清效價較低，表明該方法沒有很好的免疫效果。 

近期人們對DNA疫苗的改進(jìn)主要在以下2個方面：（1）采用更加高效的免疫途徑—利用基因槍和電穿孔技術(shù)將DNA質(zhì)粒導(dǎo)入到機(jī)體細(xì)胞內(nèi)，免疫效果得到顯著提升。（2）混合免疫沖擊。首先用DNA質(zhì)粒進(jìn)行免疫，然后利用重組蛋白、滅活的病毒或者減毒活疫苗沖擊，這種方法比常規(guī)的免疫沖擊采用同種抗原的效果要好很多。總體而言，在小型動物進(jìn)行基因免疫的效果要優(yōu)于大型動物。這一特點(diǎn)也預(yù)示著可以采用此方法開發(fā)高質(zhì)量的小鼠單克隆抗體?？紤]到DNA免疫誘導(dǎo)這種應(yīng)答的獨(dú)特優(yōu)勢，早期的研究主要集中在T細(xì)胞免疫應(yīng)答上。很少有人關(guān)注DNA免疫誘導(dǎo)B細(xì)胞免疫應(yīng)答的在實(shí)際應(yīng)用中的價值。事實(shí)上，誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答更加適合開發(fā)高質(zhì)量的功能性的單克隆抗體。

Meredith Hazen, Sunil Bhakta等用DNA免疫開發(fā)了一個抗多次跨膜蛋白（multi-drug resistant protein 4，MRP4）的單克隆抗體，MPR4是12次跨膜蛋白, 與腫瘤的多藥耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。腫瘤多藥耐藥性的產(chǎn)生對癌癥的治療是一個很大的挑戰(zhàn)。以下為單克隆抗體的檢測數(shù)據(jù)：

 

圖1 anti MRP4抗體的檢測結(jié)果

影響基因免疫開發(fā)單克隆抗體的因素：

01插入抗原序列的設(shè)計(jì)及優(yōu)化

DNA疫苗是用哺乳動物表達(dá)載體構(gòu)建的。表達(dá)載體的選擇與設(shè)計(jì)的免疫原插入序列對抗體的功能有非常重要的影響。經(jīng)典的抗體開發(fā)流程，往往需要表達(dá)重組蛋白。針對某些蛋白，特別是多次跨膜的GPCR蛋白和離子通道蛋白，全長表達(dá)非常困難，蛋白序列和結(jié)構(gòu)的完整性對開發(fā)功能性抗體是非常關(guān)鍵的。無論是天然蛋白提取純化還是重組蛋白的表達(dá)純化，在操作處理過程中，蛋白的空間結(jié)構(gòu)極有可能會發(fā)生改變。通過基因免疫產(chǎn)生的抗體能識別蛋白構(gòu)象表位的概率要大很多。主要原因在于外源基因可以在體內(nèi)直接表達(dá)合成具有天然構(gòu)象的全長蛋白，從而引起對應(yīng)的免疫應(yīng)答。

DNA疫苗對于抗原序列的選擇有獨(dú)特的優(yōu)勢。大部分情況下，會選擇表達(dá)全長蛋白序列，特別是多次跨膜蛋白，都有非常好的效果。而針對胞內(nèi)表達(dá)的蛋白，設(shè)計(jì)者如果想改變蛋白表達(dá)的定位，可以人為的設(shè)計(jì)不同的信號肽，將胞內(nèi)蛋白通過不同的信號肽的作用變成分泌表達(dá)蛋白，這樣可以增強(qiáng)免疫效果。同樣，對于一次跨膜蛋白，我們可以設(shè)計(jì)只針對胞外區(qū)的抗原序列，這樣產(chǎn)生的抗體就是只識別胞外區(qū)的表位。開發(fā)針對細(xì)菌毒素的抗體，可以選擇設(shè)計(jì)細(xì)菌毒素的某個片段序列，而不是全長，從而避免動物免疫過程中出現(xiàn)意外情況。

DNA疫苗的另外一個優(yōu)勢就是可以用相同的載體質(zhì)粒構(gòu)建過表達(dá)細(xì)胞株作為單克隆抗體的篩選材料，從而省略了蛋白表達(dá)純化的步驟。根據(jù)不同蛋白的宿主來源，可以選擇不同的篩選策略，詳情見表2。基于過表達(dá)細(xì)胞株的篩選方法已經(jīng)被應(yīng)用于開發(fā)抗跨膜蛋白、病毒衣殼蛋白和胞內(nèi)蛋白的單克隆抗體篩選中。在上述案例中，可以采用FACS，全細(xì)胞elisa或者IHC篩選替代傳統(tǒng)的重組蛋白間接elisa篩選。還有的研究人員采用一種新型的in-cell Western的方法篩選針對胞內(nèi)表達(dá)、膜表達(dá)或者核表達(dá)的蛋白抗體。

表1：開發(fā)單克隆抗體中使用的DNA疫苗的抗原序列來源

 表2：單克隆抗體的篩選方法

02表達(dá)載體的選擇

DNA疫苗載體的啟動子序列是非常關(guān)鍵的調(diào)控元件。有研究通過比較CMV和human ubiquitin C promoter兩種啟動子對于免疫效果的影響，發(fā)現(xiàn)這兩種啟動子都能最終獲得具有生物反應(yīng)活性的高特異性的單克隆抗體，但是human ubiquitin C promoter這個啟動子只需要一次尾靜脈注射免疫就能使小鼠在七周之內(nèi)維持非常高的血清效價。相對于常用的CMV啟動子，還有一種高效的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的啟動子--CAG(CMV/actin/Globin)，也能顯著的增強(qiáng)免疫效果。

03表達(dá)載體的選擇

免疫方法大致分為2類：第一種方法是將人工合成DNA質(zhì)粒進(jìn)行注射免疫，在注射緩沖液中通過加入脂質(zhì)體或者納米粒子可以增強(qiáng)免疫效果。第二種方法是基于物理外力作用的基因槍技術(shù)和電穿孔技術(shù)?；驑尲夹g(shù)是將DNA質(zhì)粒跟金納米粒子結(jié)合在一起后，再借助高壓氣流將納米粒子高速射入組織細(xì)胞內(nèi)部。電穿孔技術(shù)首先是將DNA疫苗注射進(jìn)入體內(nèi)，然后在注射位置施加電流?？傮w而言，基因槍和電穿孔的免疫方法比注射免疫的方法引起動物產(chǎn)生免疫反應(yīng)的效果要好很多，同時更加節(jié)省實(shí)驗(yàn)材料。另外還有尾靜脈注射免疫和脾臟免疫，均能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生對應(yīng)的抗體。免疫時間間隔一般1周免疫一次，第四次免疫之后就可以檢測血清免疫效果。具體免疫方法和蛋白結(jié)構(gòu)分類如下表：

 

 圖2：小鼠尾靜脈注射免疫操作流程

?04免疫佐劑?

在最開始研究人類DNA疫苗的時候，由于免疫效果較差，人們開始尋找合適的免疫佐劑以增強(qiáng)免疫效果。有文獻(xiàn)報(bào)道，腸桿菌伴侶蛋白Escherichia coli chaperone protein (GroEL) 被證實(shí)可以作為一種DNA免疫的分子佐劑。在開發(fā)針對GPCR的抗體過程中可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。FLT3(fetal liver tyrosine kinase 3 ligand)和GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)也可以作為一種免疫佐劑，在增強(qiáng)免疫效果的同時，還能誘導(dǎo)產(chǎn)生識別天然蛋白的胞外區(qū)序列的抗體。

05DNA免疫-蛋白沖擊

有一種DNA免疫-蛋白沖擊的混合免疫方法，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價和高親和力抗體。這種方法前面采用常規(guī)的DNA免疫，最后一次免疫沖擊采用重組蛋白，多肽或者滅活的病毒疫苗。

傳統(tǒng)的雜交瘤細(xì)胞融合開發(fā)抗體的方法在取脾臟融合之前需要進(jìn)行免疫沖擊，以獲得有足夠多的能產(chǎn)生目的抗體的B細(xì)胞?；蛎庖叩姆绞揭餐瑯有枰M(jìn)行沖擊，一般采用靜脈注射或者腹腔注射的方法，在融合之前的3-5天進(jìn)行。有研究表明，如果采用DNA免疫的方法在細(xì)胞融合之前沒有進(jìn)行沖擊，總體的融合率，抗體的親和力都會比較低，同時大部分得到的抗體都是IgM的亞型。

小結(jié)：

DNA免疫開發(fā)高質(zhì)量的單克隆抗體有著以下獨(dú)特的優(yōu)勢：

（1）可以高效地測試不同的抗原序列的免疫效果；

（2）不需要表達(dá)或者純化抗原。特別是針對某些致病類抗原，從而避免了生物安全性的問題。

（3）針對某些突發(fā)的傳染性疾病，一旦基因序列被確認(rèn)，就可以快速開發(fā)對應(yīng)的抗體。

（4）可以開發(fā)針對構(gòu)象表位的抗體；

（5）可選擇的免疫宿主廣泛，包括小鼠、兔子和人。

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普健生物目前正在進(jìn)行基因免疫開發(fā)單克隆抗體的測試，主要是針對PDL1，PD1以及一些膜蛋白的項(xiàng)目，目前已有項(xiàng)目正在進(jìn)行亞克隆，歡迎有需要的客戶咨詢。

另外，應(yīng)廣大客戶要求，本實(shí)驗(yàn)室提供以下單克隆抗體開發(fā)相關(guān)的關(guān)鍵試劑，質(zhì)量有保障，歡迎大家選購：

	特點(diǎn)
單組分TMB	不需要A/B液，反應(yīng)快，5min之內(nèi)出結(jié)果。
雜交瘤細(xì)胞株sp2/0	融合率高， 1次融合穩(wěn)定在4000個融合克隆以上，最高融合克隆數(shù)可達(dá)10000以上，融合板及亞克隆7-10天即可進(jìn)行ELISA篩選；融合細(xì)胞不需要飼養(yǎng)細(xì)胞。
羊抗鼠二抗	質(zhì)量穩(wěn)定，效價高。

參考文獻(xiàn)：

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