蛋白質(zhì)重組表達(dá)通常會融合蛋白或多肽標(biāo)簽以便于重組蛋白的表達(dá)，示蹤和純化等，常見標(biāo)簽有His*6，GST，Strep，F(xiàn)c，MBP，F(xiàn)lag和組合式雙標(biāo)簽或多標(biāo)簽。
GST，MBP，F(xiàn)c等蛋白標(biāo)簽由于分子量較大，通常需要酶切去除，以消除其對目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的影響；多肽標(biāo)簽分子量較小，免疫原性較低，基本不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，通?？梢圆挥妹盖腥コ?，但用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)或其他較高級研究的蛋白通常也要將小分子量多肽標(biāo)簽酶切去除，以達(dá)到最佳效果。
去除標(biāo)簽的關(guān)鍵在于選擇合適的蛋白酶并構(gòu)建相應(yīng)的氨基酸識別序列。常用的蛋白酶及對應(yīng)的酶切位點(diǎn)如下表：
下面我們對五種常見的蛋白內(nèi)切酶做個簡單介紹
01
SUMO protease: 又叫Ulp，是重組表達(dá)的釀酒酵母ULP1(Ubl-specific protease 1)片段，它能夠特異性識別SUMO融合蛋白的空間結(jié)構(gòu)而不是的氨基酸序列。SUMO protease優(yōu)點(diǎn)有：特異性好（無非特異切割），活性高，酶切條件溫和，緩沖液耐受好等特點(diǎn)，可以各種常見緩沖液體系中高效切除SUMO融合蛋白。由于SUMO標(biāo)簽具有極佳的促溶和促表達(dá)交效果，SUMO標(biāo)簽與SUMO protease是重組蛋白表達(dá)中最常見融合蛋白標(biāo)簽與蛋白內(nèi)切酶的組合。
推薦指數(shù)：★★★★★
圖1. SUMO protease結(jié)合SUMO標(biāo)簽
圖2. SUMO protease切割目標(biāo)蛋白
02
HRV 3C Protease：重組表達(dá)的人源3C Protease，是一種半胱氨酸蛋白酶，能特異識別氨基酸序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro，并在谷氨酰胺(Gln)和甘氨酸(Gly)之間切開。普健生物的HRV 3C Protease經(jīng)過嚴(yán)格的測試，具有酶活高，可在不同pH，不同溫度，含咪唑的條件下識別并切割目標(biāo)序列。
推薦指數(shù)：★★★★★
圖3. HRV 3C Protease切割目標(biāo)蛋白
03
Enterokinase：腸激酶是一種絲氨酸蛋白水解酶，能高效專一地識別蛋白質(zhì)中Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓(DDDDK↓)序列，并在賴氨酸(Lys, K)的C端水解肽鍵。普健生物的重組表達(dá)的腸激酶具有極高的酶切活性。腸激酶的最大優(yōu)勢在于當(dāng)識別序列融合在蛋白標(biāo)簽的C端時，可以達(dá)到酶切后無氨基酸殘留，深受科研工作者喜愛；然而腸激酶的酶切條件要求比較苛刻，需在無鹽離子，室溫或37度溫育時才能發(fā)揮最高活性，對于鹽濃度敏感或溫度敏感的蛋白酶切時容易發(fā)生沉淀。普健生物積累了一套應(yīng)對腸激酶酶切蛋白發(fā)生沉淀的應(yīng)對策略，歡迎大家留言咨詢。
推薦指數(shù)：★★★★
圖4. Enterokinase切割目標(biāo)蛋白
04
TEV protease：是一種重組表達(dá)的半胱氨酸蛋白酶，能特異性地識別七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly/Ser，并在Gln和Gly/Ser氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切。TEV Protease的最佳酶切溫度是30℃，在4℃時也保留了一定的活性，為盡可能保留目標(biāo)蛋白活性，在實(shí)際操作中常用4℃過夜酶切。
推薦指數(shù)：★★★★
05
Thrombin：凝血酶來源于牛血漿，分子量37 kD，是由兩條肽鏈(31 kD和6 kD)通過二硫鍵組成的。37℃時, 凝血酶活性很高，溫度降低活性也隨之降低，在4℃時基本無酶切活性，所以實(shí)驗(yàn)室使用凝血酶切割目標(biāo)蛋白時常采用室溫酶切或37℃水浴酶切。但熱不穩(wěn)定蛋白在室溫或37℃水浴酶切過程中很有可能會發(fā)生失活或者沉淀，且凝血酶為牛血漿分離提取，純度低，需要用苯甲脒瓊脂糖才能將酶從蛋白樣品中去除，故并不推薦使用。普健生物積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)來解決凝血酶酶切過程中目標(biāo)蛋白受熱沉淀的難題，歡迎大家留言咨詢。
推薦指數(shù)：★★
用什么酶可以把抗體切成F(ab)2和Fc？大家第一時間想到的肯定是胃蛋白酶。但是胃蛋白的酶對抗體的切割要在極端的酸性條件下完成，且切割位點(diǎn)并不專一，酶切時間短了，大部分抗體未被切開，酶切時間長了，又會發(fā)生非特異切割。為了切一個抗體，要藥費(fèi)大量時間來摸索酶濃度梯度和酶切時間梯度。我們將推出抗體酶切篇來幫您節(jié)約寶貴時間，輕松搞定抗體酶切，敬請關(guān)注。
