穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建的第一個步驟就是細(xì)胞轉(zhuǎn)染，這項實(shí)驗的原理大家都清楚，但是為什么一上手就會出現(xiàn)多種問題，在實(shí)驗第一步就栽了跟頭呢？
是細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法不對頭？還是實(shí)驗過程中的某個因素影響了轉(zhuǎn)染效率？了解本文這11個注意事項，讓你的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗順利通關(guān)！
所謂轉(zhuǎn)染，是指在真核細(xì)胞里導(dǎo)入具有生物功能的核酸并核酸的生物功能。通常選用的轉(zhuǎn)染方法包括物理介導(dǎo)法（如電穿孔法、顯微注射和基因槍等）、化學(xué)介導(dǎo)法（如磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)法）、生物介導(dǎo)法（如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染等）。上述方法中，實(shí)驗室最常用的方法當(dāng)屬是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作簡單，分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。針對不同屬性細(xì)胞系，選擇轉(zhuǎn)讓方式時要做足功課，千萬不要圖方便，否則轉(zhuǎn)染效率簡直崩潰。影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多，比如準(zhǔn)備不充分、轉(zhuǎn)染條件不佳；再比如細(xì)胞株本身的特性和活性、細(xì)胞污染，轉(zhuǎn)染的DNA/RNA的質(zhì)量，轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染試劑的選擇等，小編總結(jié)了這11個注意事項，一起來學(xué)習(xí)吧！
01血清條件下的細(xì)胞轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染可以使用血清，前提是DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時不含血清，否則會降低轉(zhuǎn)染效率（血清會影響復(fù)合物的形成）。
轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加，如加血清則應(yīng)在DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成后加入，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對條件進(jìn)行優(yōu)化。
對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞，建議使用專用轉(zhuǎn)染試劑。條件允許情況下，可以用無血清培養(yǎng)基代替PBS洗細(xì)胞兩遍，注意洗的時候要輕，靠邊緣緩緩加入液體，然后不要吹吸細(xì)胞，而是轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板讓液體滾動在細(xì)胞表面。如果洗的太厲害，細(xì)胞又損失一部分，加了脂質(zhì)體后，細(xì)胞受影響就更大了，死亡細(xì)胞會增多。
02培養(yǎng)基中的抗生素（PS）
抗生素（如青霉素、鏈霉素等）是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。由于陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使得對真核細(xì)胞無毒的抗生素進(jìn)入細(xì)胞，從而降低細(xì)胞活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。因此，應(yīng)避免在轉(zhuǎn)染前細(xì)胞鋪板時和在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用抗生素，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。
03細(xì)胞狀態(tài)
眾所周知，細(xì)胞的生長狀態(tài)影響實(shí)驗結(jié)果，原代細(xì)胞和傳代次數(shù)多的細(xì)胞都不是最佳選擇，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞生長狀態(tài)最好，最適合轉(zhuǎn)染。有文獻(xiàn)研究傳代不要超過17代，細(xì)胞復(fù)蘇后的3代左右時細(xì)胞狀態(tài)最好，傳代過多細(xì)胞形態(tài)都會發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。
04細(xì)胞鋪板密度
用于轉(zhuǎn)染的最佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞有毒害作用，細(xì)胞太少，容易死。一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實(shí)驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做。
05啟動子的選擇
獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤病毒)相比，在BHK-21中其活性最高。這三種病毒啟動子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細(xì)胞中CMV啟動子，而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達(dá)在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。
06DNA量
高質(zhì)量的DNA對于進(jìn)行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒一定純度好、濃度高、無內(nèi)毒素。濃度不要低于0.35ug/ul。產(chǎn)物表達(dá)，48小時mRNA表達(dá)最高；72h蛋白表達(dá)最高。
07瞬時/穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)
穩(wěn)定基因表達(dá)符合長期生產(chǎn)需求。整個實(shí)驗操作流程提供長期穩(wěn)定及規(guī)?？烧{(diào)的蛋白生產(chǎn)。與穩(wěn)定基因表達(dá)相比，瞬時表達(dá)（TGE）主要適用于短期內(nèi)制備重組蛋白，普健生物的瞬時表達(dá)使用懸浮細(xì)胞，能夠完成mL到100L的體積的蛋白表達(dá)，一般在10天內(nèi)即可快速轉(zhuǎn)染，無需質(zhì)粒DNA的遺傳性選擇。
08轉(zhuǎn)染效率監(jiān)測
基因的瞬時表達(dá)在24-72小時內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時表達(dá)非常適用于驗證質(zhì)粒表達(dá)和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率。
可以使用報告基因來確定優(yōu)化條件，其表達(dá)蛋白易檢測，在目的細(xì)胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）?？梢允褂煤唵蔚姆峭凰胤椒z測b-gal的表達(dá)以測定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMV SPORT- bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ基因，轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞內(nèi)后可以直接表達(dá)bgal。結(jié)合簡單的檢測步驟，可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。
09穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選
用載體中所含的選擇標(biāo)志進(jìn)行篩選是建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系最常用的方法?？股乜剐曰蚩梢耘c目的基因在同一個質(zhì)粒上，也可以在不同的質(zhì)粒上。如果兩個不同的質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染，兩個質(zhì)粒都可能整合形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。對于兩種不同質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，帶有目的基因的質(zhì)粒和帶有篩選標(biāo)記的質(zhì)粒間的比例為3:1或更高以保證抗性克隆帶有轉(zhuǎn)染的目的基因。
10蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇
哺乳動物細(xì)胞系合成可溶的、翻譯后修飾的蛋白，比細(xì)菌，真菌或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白更有可能有生物活性。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以合成大量的重組蛋白，而瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以快速表達(dá)，迅速地合成小量蛋白。普健生物使用細(xì)胞系包括CHO，HEK293,CHO-S,CHO-K1等常用細(xì)胞系。普健生物提供克隆的HEK293，CHO-S，DG44和CHO-K1細(xì)胞，來源于經(jīng)篩選轉(zhuǎn)染效率更高的亞細(xì)胞系。這些細(xì)胞也可用于無血清和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基。重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)一般在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞中進(jìn)行。這些細(xì)胞易于生長到高密度并合成更多蛋白，使用基質(zhì)珠做為固相支持可以使貼壁細(xì)胞懸浮生長。
11轉(zhuǎn)染效率的驗證
最有效的驗證方式必須是qPCR驗證。
熒光觀察，使用病毒轉(zhuǎn)染，明白自己病毒的情況，是熒光標(biāo)記（一般是GFP）還是非熒光標(biāo)記。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，可以在載體上添加熒光標(biāo)記，幫助自己通過熒光觀察轉(zhuǎn)染效率。但是熒光并不能完全證明轉(zhuǎn)染效率，還是通過核酸驗證最為準(zhǔn)確。