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武漢佰樂博生物技術(shù)有限公司
   
     
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利用Single B方法快速制備高效BSA抗體對(duì)的策略

發(fā)表時(shí)間:2023-06-21
研究背景

殘余牛血清白蛋白(BSA)含量檢測(cè)是生物制品質(zhì)量控制的一項(xiàng)重要指標(biāo),直接關(guān)系到生物制品的使用安全。世界衛(wèi)生組織及世界各國(guó)藥典對(duì)殘余BSA含量均有嚴(yán)格限定?!吨袊?guó)藥典》(三部)2020版規(guī)定,成品中牛血清白蛋白殘留量不得>50ng/劑。因此,需要利用特異性好,靈敏度高的抗體建立一種簡(jiǎn)便、高效的牛血清白蛋白殘留量檢測(cè)方法。


客戶痛點(diǎn)

牛血清廣泛使用于生物制品研究、制備過程中,雖然在生產(chǎn)過程中經(jīng)純化可以去除制品中大部分BSA,但微量BSA依然存在于生物制劑成品中。在人體中,超過一定濃度的BSA易引起人的免疫病理反應(yīng),引起嚴(yán)重的副作用,影響生物制品的安全性。普健生物基于客戶需求,對(duì)BSA有更為嚴(yán)苛的控制標(biāo)準(zhǔn),此前我們基于鼠抗開發(fā)平臺(tái)開發(fā)出靈敏度為0.51ng/ml,可檢測(cè)1.56-100ng/mL的BSA檢測(cè)試劑盒。能滿足現(xiàn)行藥典規(guī)范BSA殘留檢測(cè)要求,并有了穩(wěn)定的客戶群體。但在后續(xù)的產(chǎn)品回訪中,我們的項(xiàng)目經(jīng)理進(jìn)一步了解了客戶的項(xiàng)目對(duì)BSA殘留其實(shí)有更為嚴(yán)苛的控制標(biāo)準(zhǔn),只是苦于市售產(chǎn)品檢測(cè)限以及靈敏度未能完全滿足。普健生物技術(shù)團(tuán)隊(duì)深挖客戶需求,結(jié)合普健生物最新推出的XtenTMMab兔單克隆抗體開發(fā)技術(shù),為客戶提供了一種全新、高效、高靈敏度的BSA檢測(cè)解決方案。


普健全新解決方案

本公司利用兔單B細(xì)胞抗體開發(fā)技術(shù),從BSA免疫的兔外周血中,分離BSA特異性的單B細(xì)胞,通過PCR 擴(kuò)增及測(cè)序分析, 獲得多個(gè)特異性識(shí)別BSA蛋白的抗體。

本方案篩選的兔單抗較傳統(tǒng)方法雜交瘤技術(shù)篩選的抗體及兔多抗的親和力和特異性更高,具有靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn),檢測(cè)范圍為0.78-50ng/mL,為開發(fā)高靈敏度的BSA殘留檢測(cè)試劑盒奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

圖1 普健生物XtenTMMab兔單克隆抗體開發(fā)流程


01動(dòng)物免疫及單B細(xì)胞分選

利用普健生物開發(fā)的快速免疫方法免疫新西蘭大白兔,三免(Day21)血清效價(jià)大于128K,可以進(jìn)行后續(xù)單B細(xì)胞流式分選。然后將從PBMC中分離篩選到的B細(xì)胞進(jìn)行抗原特異性檢測(cè),陽性率大于60%。

抗原

BSA

包被

1ug/ml*100ul


2k

4k

8k

16k

32k

64k

128k

PBS

效價(jià)

免血清效價(jià)

4.32

3.32

3.26

2.98

2.53

1.85

1.16

0.03

>128K

圖2 BSA兔血清三免(Day21)效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

圖3 單B細(xì)胞ELISA檢測(cè)部分結(jié)果展示


02陽性抗體測(cè)序及序列分析

根據(jù)單B細(xì)胞ELISA檢測(cè)結(jié)果,挑選12個(gè)克隆進(jìn)行抗體基因測(cè)序及分析,12個(gè)克隆測(cè)序全部成功。


圖4 抗體可變區(qū)基因分析結(jié)果


03重組兔抗表達(dá)及鑒定

將測(cè)序得到的12個(gè)抗體挑選10個(gè),利用普健生物自主開發(fā)的XtenCHO系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá),純化后得到純度高,親和力好的重組兔單抗。10株重組兔單抗ELISA效價(jià)均大于1:1000000。

圖5 重組兔抗SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

圖6 純化后重組兔抗ELISA檢測(cè)結(jié)果


04BSA抗體對(duì)開發(fā)

將10株重組兔單抗進(jìn)行方陣實(shí)驗(yàn)配對(duì),得到多對(duì)靈敏度高的抗體對(duì),優(yōu)選其中一對(duì), 標(biāo)曲線性范圍0.78-50ng/mL, R2=0.9992。

圖7 BSA抗體對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線


05抗BSA鼠單抗和兔單抗親和力比較

為了了解不同方法制備抗體親和力的差異,我們將BSA的兔單抗與之前自產(chǎn)的用傳統(tǒng)雜交瘤制備的BSA鼠單抗進(jìn)行了親和力的測(cè)試。在此,我們利用OPENSPR將鼠單抗、兔單抗和BSA進(jìn)行了親和力檢測(cè),發(fā)現(xiàn)兔單抗的親和力比鼠單抗高1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。


ka(1/Ms) kd (1/s) KD (M)
BSA&兔抗3D5

2.21E+05

1.90E-05

8.61E-11

BSA&兔抗6B7 1.39E+05 7.49E-06 5.38E-11
BSA&鼠抗1 2.81E+04 1.39E-04 4.95E-09
BSA&鼠抗2 1.48E+05 2.02E-05 1.36E-10

剩余未分選的B細(xì)胞以及篩選陽性的其他單B細(xì)胞可以凍存,以便用于后續(xù)篩選其他應(yīng)用需求的抗體。

聯(lián)系我們

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普健生物(AtaGenix)于2012年在武漢成立,作為武漢國(guó)家生物產(chǎn)業(yè)基地公共服務(wù)平臺(tái)—光谷抗體發(fā)現(xiàn)與篩選公共服務(wù)平臺(tái)。普健生物(AtaGenix)專注于重組蛋白、抗體、診斷原料、抗體藥物發(fā)現(xiàn)等自主技術(shù)平臺(tái)的建設(shè)和下游生物醫(yī)藥產(chǎn)品的戰(zhàn)略合作。經(jīng)過10年的發(fā)展,普健生物已成為一家立足武漢,業(yè)務(wù)覆蓋全國(guó)、輻射全球的高新技術(shù)服務(wù)企業(yè)。目前公司擁有4200平米自建實(shí)驗(yàn)室(包含800平高標(biāo)準(zhǔn)BSL-2級(jí)細(xì)胞房),擁有齊全蛋白抗體開發(fā)設(shè)備500余套,包括高通量蛋白純化儀、Agilent 流式細(xì)胞分析儀,全自動(dòng)HPLC分析儀,openSPR蛋白、抗體親和力測(cè)定儀,Olympus熒光顯微鏡,BTX電融合儀,2*7L微生物發(fā)酵罐,中試型高壓均質(zhì)機(jī),全自動(dòng)管式化學(xué)發(fā)光儀,以及配套的高速離心機(jī),細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及大容量細(xì)胞培養(yǎng)搖床。公司先后獲得榮譽(yù):3551人才計(jì)劃、高新技術(shù)企業(yè)、技術(shù)先進(jìn)型服務(wù)企業(yè)、光谷瞪羚企業(yè)

普健生物依托自主研發(fā)的高通量活性蛋白表達(dá)系統(tǒng),Single B細(xì)胞抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)平臺(tái),噬菌體展示抗體庫技術(shù)和雜交瘤抗體開發(fā)平臺(tái),抗體表達(dá)、抗體人源化和穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建平臺(tái),與各研究機(jī)構(gòu)展開技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目合作,助力IVD檢測(cè)、疫苗生產(chǎn)、重組抗體開發(fā)。

普健生物一站式抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái),專注于活性蛋白,功能性抗體開發(fā)。


武漢國(guó)家生物產(chǎn)業(yè)基地—光谷抗體發(fā)現(xiàn)與篩選公共服務(wù)平臺(tái)

一站式抗體發(fā)現(xiàn)整體解決方案

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