單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)是一種通用的高度特異性結(jié)合蛋白，長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是對(duì)抗疾病的“魔彈”，也是臨床和科研等其他生物學(xué)用途的重要工具。然而這些應(yīng)用只有在實(shí)現(xiàn)離單個(gè)抗體的方法出現(xiàn)后才得以實(shí)現(xiàn)，雜交瘤技術(shù)就是這把將打開單抗應(yīng)用大門的“金鑰匙”。
雜交瘤技術(shù)是基于特定的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合，分離出針對(duì)給定抗原的單抗(MAbs)的常用技術(shù)。雜交瘤技術(shù)的出現(xiàn)徹底改變了傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)和研究領(lǐng)域，隨著1984年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)進(jìn)一步認(rèn)可，雜交瘤技術(shù)越來越成熟的同時(shí)還不斷發(fā)展，隨之出現(xiàn)了噬菌體展示技術(shù)和單一B細(xì)胞抗體展示技術(shù)，越來越多的新技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域，填補(bǔ)了雜交瘤策略的局限性。

雜交瘤細(xì)胞技術(shù)
由Georges K?hler和Cesar Milstein于1975年描述的雜交瘤技術(shù)是基于用所需抗原免疫動(dòng)物，然后將特異性B淋巴細(xì)胞與“不朽”骨髓瘤細(xì)胞融合。產(chǎn)生的雜交細(xì)胞，稱為雜交瘤，然后被克隆以獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞系。在選擇感興趣的抗體分泌克隆后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到大規(guī)模培養(yǎng)裝置中，以產(chǎn)生所需數(shù)量的抗體。
B淋巴細(xì)胞-骨髓瘤細(xì)胞融合通常通過使用化合物聚乙二醇(PEG)獲得。然而，這種藥物在一定程度上可能具有細(xì)胞毒性，并可能發(fā)生非特異性膜融合。另一種是通過珍珠鏈法，在電場(chǎng)和激光輻射的幫助下進(jìn)行聚變。在這種情況下，用脈沖激光束照射接觸細(xì)胞表面，在細(xì)胞膜上形成一個(gè)小穿孔，這增加了促進(jìn)細(xì)胞融合的機(jī)會(huì)。盡管珍珠鏈方法比PEG介導(dǎo)的策略有優(yōu)勢(shì)，但它仍然不能選擇性地控制特定B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合。
雜交瘤技術(shù)一直處于單克隆抗體產(chǎn)生領(lǐng)域的前沿。目前，超過90%被批準(zhǔn)用于臨床用途的抗體是由該技術(shù)產(chǎn)生的，其中大多數(shù)是嵌合或人源化抗體。然而，基于雜交瘤的單克隆抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)是篩選過程長(zhǎng)，特異性單克隆抗體分泌細(xì)胞的次優(yōu)選擇，在早期階段很少可能進(jìn)行單克隆抗體驗(yàn)證，更不用說需要純化抗原靶點(diǎn)的可用性。為了優(yōu)化抗體生成，多年來已經(jīng)開發(fā)了該技術(shù)的幾種變體。
B細(xì)胞靶向(BCT)
B細(xì)胞靶向(BCT)方法，也稱為脈沖電場(chǎng)(PEF)，由Lo等人于1984年描述。它基于兩個(gè)中心點(diǎn):識(shí)別感興趣抗原的B淋巴細(xì)胞的預(yù)選，以及使用直流電脈沖進(jìn)一步將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。簡(jiǎn)而言之，特定的生物素標(biāo)記抗原與相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞結(jié)合，隨后通過鏈霉親和素恢復(fù)，產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞-抗原-生物素-鏈霉親和素復(fù)合物。然后，將這種B淋巴細(xì)胞復(fù)合物與生物素標(biāo)記的骨髓瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，并將所得到的混合物暴露于PEF以促進(jìn)細(xì)胞融合。
最后一步，也是最關(guān)鍵的一步，其特點(diǎn)是靜電場(chǎng)暴露后細(xì)胞膜不穩(wěn)定，這使得細(xì)胞間融合的發(fā)生變得容易。
立體特異性靶向(SST)
構(gòu)象特異性單克隆抗體的早期描述發(fā)表于20世紀(jì)60年代，強(qiáng)調(diào)了這些抗體特異性識(shí)別特定化合物的一種立體異構(gòu)體的特征。已知立體特異性單克隆抗體對(duì)其配體具有高特異性，然而，這些單克隆抗體的產(chǎn)生在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，特別是在高度結(jié)構(gòu)化和保存良好的靶標(biāo)的情況下。例如多跨膜蛋白的胞外環(huán)或結(jié)構(gòu)域，如膜結(jié)合受體。立體特異性靶向(Stereospecific Targeting, SST)方法就是為了解決這個(gè)問題而提出的，SST方法為B淋巴細(xì)胞-骨髓瘤細(xì)胞融合提供了50%以上的陽(yáng)性，并且發(fā)現(xiàn)超過24%的生成克隆分泌所需的單克隆抗體。
噬菌體展示技術(shù)
1990年首次報(bào)道的噬菌體展示技術(shù)被認(rèn)為是生成單克隆抗體的有力工具。該方法基于George Smith在1985年描述的噬菌體展示概念，包括開發(fā)組合抗體噬菌體文庫(kù)——即大量展示抗體片段的噬菌體——以及隨后篩選識(shí)別目標(biāo)抗原的抗體。
噬菌體展示庫(kù)的構(gòu)建是該技術(shù)的重要組成部分。抗體庫(kù)的大小與找到特定抗體的概率成正比關(guān)系。下一代測(cè)序(NGS)是分析噬菌體展示文庫(kù)的變異性、序列組成和大小的重要工具。構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)比動(dòng)物免疫后產(chǎn)生雜交瘤要昂貴得多。然而，噬菌體展示技術(shù)的抗體篩選步驟更快熟、價(jià)格更優(yōu)。
雖然噬菌體展示文庫(kù)是一種前景廣闊的抗體開發(fā)技術(shù)，但它也有局限性。噬菌體文庫(kù)的多樣性取決于細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率，并且僅限于噬菌體展示文庫(kù)中10¹⁰-10¹¹變體抗體的最大庫(kù)。
單B細(xì)胞技術(shù)
以上幾種產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)平臺(tái)的一個(gè)固有特點(diǎn)是需要將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，長(zhǎng)期以來，這是分離已知特異性的單一抗體的必要步驟。
在過去的幾十年里，技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)允許從異質(zhì)原代細(xì)胞群中檢測(cè)和分離單一功能的B淋巴細(xì)胞，以及抗體基因的擴(kuò)增和克隆，而無需使選定的抗體分泌細(xì)胞(ASC)永生化。這些單一B淋巴細(xì)胞方法，統(tǒng)稱為“單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)”，顯示出快速生成中和單克隆抗體的吸引力和實(shí)用性。
單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)以單個(gè)B細(xì)胞為起始點(diǎn)，利用每個(gè)B細(xì)胞只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，直接從單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增出抗體基因，進(jìn)而獲得抗原特異性抗體。該技術(shù)所制備的抗體具有高通量、高效率、高穩(wěn)定性、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，保留了豐富的基因多樣性和輕重鏈可變區(qū)的天然配對(duì)，應(yīng)用前景廣泛，是最高效的抗體篩選方法之一。事實(shí)上，利用這種技術(shù)獲得了越來越多的針對(duì)病毒病原體感染的單克隆抗體，如HIV、登革熱、MERS-CoV和SARS-Cov-2。
普健生物依托自主研發(fā)的高通量活性蛋白表達(dá)系統(tǒng)，Single B細(xì)胞抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)平臺(tái)，噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)和雜交瘤抗體開發(fā)平臺(tái)，抗體表達(dá)、抗體人源化和穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建平臺(tái)，擁有10余年的蛋白、抗體服務(wù)經(jīng)驗(yàn)及專業(yè)的研發(fā)生產(chǎn)團(tuán)隊(duì)，可提供全面的蛋白表達(dá)、抗體制備、抗體藥物發(fā)現(xiàn)、抗體人源化、重組抗體表達(dá)等一站式抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)服務(wù)，助力IVD檢測(cè)、疫苗生產(chǎn)、重組抗體開發(fā)。
自20世紀(jì)80年代中期以來，從雜交瘤技術(shù)的變化開始，到噬菌體展示技術(shù)，再到單B細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用，越來越多的單克隆藥物從理論設(shè)計(jì)到臨床科研到獲批上市，伴隨著人類后基因組學(xué)及代謝組學(xué)的發(fā)展，越來越多的單克隆抗體藥物種類將會(huì)幫助人們的獲得更多健康和發(fā)展。