肝核因子3β (hepatocyte nuclear factor 3β, HNF 3β)作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與哺乳動(dòng)物的前腸胚和肝臟發(fā)育以及成體肝內(nèi)的能量代謝，而HNF 3β在雞(Gallus gallus)中的功能還不清楚。
肝細(xì)胞核因子(hepatocyte nuclear factor, HNF)包含HNF1、HNF2、HNF3、HNF4、HNF6和“CCAT”增強(qiáng)子結(jié)合蛋白，形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控肝細(xì)胞的分化，在胚胎發(fā)育和肝內(nèi)代謝平衡中發(fā)揮重要作用。HNF 3β又稱(chēng)Forkheadbox A2 (FOXA2)，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子3家族的一員，協(xié)同HNF 3α(FOXA1)促進(jìn)前腸內(nèi)胚層的建立和啟動(dòng)肝臟的發(fā)育；HNF 3β對(duì)成年小鼠(Mus musculus)肝內(nèi)葡萄糖和脂類(lèi)的平衡有著重要作用；HNF 3β缺陷還會(huì)影響胚泡著床和基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化，造成完全不育。
目前大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)系統(tǒng)是原核表達(dá)體系中最早被應(yīng)用、也是最為成熟和應(yīng)用最廣的一種工程性表達(dá)外源蛋白的體系，其具有宿主細(xì)胞增殖速度快、操作方便、誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)機(jī)制清晰可控及外源蛋白產(chǎn)量高等優(yōu)勢(shì)。目前關(guān)于雞HNF 3β的功能還知之甚少，特別是HNF 3β在繁育和能量代謝方面是否也具有重要作用？這是值得去研究和弄清楚的問(wèn)題。而雞HNF 3β有效抗體的缺乏，限制了對(duì)其功能的研究。為此，來(lái)自常熟理工學(xué)院的研究人員以大腸桿菌進(jìn)行工程性表達(dá)雞HNF 3β重組蛋白，并制備其抗體，為進(jìn)一步研究雞HNF 3β與靶基因的互作作用、揭示其功能提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。
本研究中，研究人員通過(guò)優(yōu)化合成了雞Hnf 3β基因編碼區(qū)片段，以pET 30a表達(dá)載體在大腸桿菌(Escherichia coli)中進(jìn)行重組蛋白HNF 3β的表達(dá)，用6 mol/L尿素變性包涵體，Ni2+對(duì)重組蛋白進(jìn)行親和層析，并以快速稀釋法復(fù)性重組蛋白，以離心超濾法收集、濃縮目的蛋白；取純化的HNF 3β重組蛋白和弗氏佐劑乳化后免疫兔(Oryctolagus cuniculus)，制備雞HNF 3β的抗血清，以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)測(cè)定抗血清效價(jià)后，用Protein A法純化抗體；通過(guò)檢測(cè)雞肝癌細(xì)胞系(leghorn male hepatoma, LMH)中HNF 3β蛋白的表達(dá)情況驗(yàn)證所制備抗體的效果。
結(jié)果表明，優(yōu)化合成的Hnf 3β基因片段在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的高效表達(dá)；在6 mol/L尿素的變性條件下，Ni2+親和層析一步法獲得純度大于95%的重組蛋白，結(jié)合快速稀釋法獲得了可溶性的重組蛋白HNF 3β；經(jīng)重組蛋白4次免疫后，抗血清效價(jià)超過(guò)1∶64 000；免疫印跡結(jié)果顯示，制備的抗體能特異性的檢測(cè)出LMH細(xì)胞中HNF 3β蛋白的表達(dá)。綜上所述，本研究利用制備的高純度重組蛋白HNF3β免疫兔獲得了高特異性和高效價(jià)的多克隆抗體，可以為檢測(cè)雞HNF 3β蛋白分子及研究其功能提供可靠的抗體。
這項(xiàng)研究根據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性?xún)?yōu)化了雞Hnf 3β基因的編碼區(qū)片段序列，該優(yōu)化的片段。提高了雞HNF 3β重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，快速稀釋復(fù)性蛋白的方法能有效地從包涵體中獲得高純度的可溶性HNF 3β重組蛋白；純度95%以上的重組蛋白免疫新西蘭大白兔獲得了較高效價(jià)的多克隆抗體，Protein A一步法制備、純化了HNF3β的多克隆抗體，抗體對(duì)HNF 3β蛋白具有較高的特異性和效價(jià)，可利用此抗體檢測(cè)雞HNF 3β蛋白分子及研究HNF 3β的功能。
參考文獻(xiàn)
[1]張景,潘玲,毛威威等.雞HNF 3β重組蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)及其抗體制備[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2022,30(04):809-816.
