2024-06-18
糖基化修飾在藥物蛋白功能、穩定性及血漿半衰期等方面起到重要作用。真核生物中糖基化修飾蛋白在維持蛋白穩定、細胞信號轉導、免疫調控、細胞間的互作、細菌-宿主識別互作等過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)重要功能。
N-糖基化修飾是蛋白糖修飾的主要方式之一,寡糖通過(guò)與新生肽鏈中特定天冬酰胺的酰胺氮連接。在原核生物中也廣泛存在寡糖合成途徑與 N-糖基化修飾蛋白質(zhì)機制,形成病原菌外膜上的脂寡糖。脂寡糖在病原菌黏附和宿主細胞侵入、逃避宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用。
大腸埃希菌是人體不可缺少單細胞生物。大腸埃希菌,俗名大腸桿菌(革蘭氏陰性短桿菌),周身鞭毛,能運動(dòng),無(wú)芽。是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌。
2002 年,瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院Wacker 等研究人員首次將空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni) N-糖基化基因簇( pgl) 轉入大腸桿菌,成功地在大腸桿菌工程菌株中N-糖基化修飾外源蛋白質(zhì),開(kāi)創(chuàng )了利用大腸桿菌 N-糖基化修飾重組蛋白新紀元。近 20 年間,人們利用不同來(lái)源的糖基化轉移酶、寡糖轉移酶,在大腸桿菌中開(kāi)展類(lèi)人源和人源化 N-糖基化重組蛋白、病原菌寡糖的糖疫苗制備研究。
利用大腸桿菌表達系統制備N-糖基化重組蛋白的機制
天然原核生物 N-糖基化修飾系統主要由4個(gè)必要元件組成:糖基化識別序列、糖基轉移酶
(glycosyl transferase,GT) 、糖苷酶、糖底物供體,它們分別負責接受、添加、修剪和提供底物以合成寡糖,并進(jìn)一步通過(guò)依賴(lài)寡糖轉移酶( oligosaccharyl transferase,OST) /非依賴(lài) OST的途徑將寡糖轉移到靶蛋白上。將以上機制轉移到大腸桿菌中,實(shí)現 N-糖基化重組蛋白,可重塑合成寡糖鏈及重組蛋白修飾,將在糖疫苗生產(chǎn)、糖基化修飾藥物蛋白等方面具有巨大應用潛力。
Schematic diagram of the main mechanism of N-glycosylated recombinant protein production via Escherichia coli
A: OST-dependent N-glycosylation system; B: OST-independent N-glycosylation system
應用大腸桿菌表達系統制備N(xiāo)-糖基化重組蛋白
利用大腸桿菌表達系統生產(chǎn)糖基化基因工程抗體等重組蛋白及糖疫苗是目前熱點(diǎn)研究方向。自2012 年Aebi課題組首次利用大腸桿菌實(shí)現類(lèi)人源化糖鏈Man3GlcNAc2核心五糖 N-糖基化修飾重組蛋白后,利用多種原核生物進(jìn)行糖基化修飾的技術(shù)一直在不斷探索中,其技術(shù)核心是將其他原核生物來(lái)源的寡糖轉移酶(識別并將寡糖轉移到重組蛋白上的糖基化識別序列上)和多種糖基轉移酶(非模板驅動(dòng)合成寡糖)在大腸桿菌中共表達,完成寡糖合成及 N-糖基化定點(diǎn)修飾蛋白基本過(guò)程。
近幾年研究結果表明該系統可以實(shí)現定點(diǎn)(識別特異氨基酸序列)、均質(zhì)性(糖鏈微觀(guān)均質(zhì)、糖蛋白宏觀(guān)均質(zhì))修飾重組蛋白,這是真核系統無(wú)法比擬的優(yōu)勢。真核細胞合成的聚糖性質(zhì)較其他合成途徑而言與人的更為相似(如圖)。但是,天然真核細胞表達系統糖表位修飾N-糖基化重組蛋白的均質(zhì)性很低,這種異質(zhì)性源于哺乳動(dòng)物復合型N-多糖合成的多步驟過(guò)程。
Schematic diagram of antibody glycosylation modification in eukaryotic cells
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Schematic diagram of the production of N-glycosylated recombinant proteins using Escherichia coli
A: Recombinant protein pathway modified by N-glycosylation in Escherichia coli; B: Cell-free glycoprotein synthesis pathway
O-糖基化修飾可以增加治療性蛋白的穩定性和體內循環(huán)時(shí)間。雖然糖基化修飾對每種蛋白質(zhì)的影響可能不同,但研究顯示N-糖基化修飾可通過(guò)以下方式改善蛋白的理化性質(zhì):
①通過(guò)屏蔽非結構化、疏水性或易于蛋白酶作用的蛋白質(zhì)區域來(lái)防止變性、聚集和降解;
②增加分子的分子量和流體動(dòng)力學(xué)半徑以減少腎濾過(guò);
③去除免疫原性,減少免疫系統清除;
④覆蓋或去除可被人凝集素識別/清除的末端結構。
目前,利用大腸埃希菌解決了均質(zhì)性修飾N-糖基化修飾重組蛋白問(wèn)題。該技術(shù)有望首先在糖疫苗生產(chǎn)方面得到產(chǎn)業(yè)化應用。
參考文獻
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