糖基化修飾在藥物蛋白功能、穩定性及血漿半衰期等方面起到重要作用。真核生物中糖基化修飾蛋白在維持蛋白穩定、細胞信號轉導、免疫調控、細胞間的互作、細菌-宿主識別互作等過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)重要功能。

N-糖基化修飾是蛋白糖修飾的主要方式之一，寡糖通過(guò)與新生肽鏈中特定天冬酰胺的酰胺氮連接。在原核生物中也廣泛存在寡糖合成途徑與 N-糖基化修飾蛋白質(zhì)機制，形成病原菌外膜上的脂寡糖。脂寡糖在病原菌黏附和宿主細胞侵入、逃避宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用。

大腸埃希菌是人體不可缺少單細胞生物。大腸埃希菌，俗名大腸桿菌（革蘭氏陰性短桿菌），周身鞭毛，能運動(dòng)，無(wú)芽。是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌。

2002 年，瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院Wacker 等研究人員首次將空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni) N-糖基化基因簇( pgl) 轉入大腸桿菌，成功地在大腸桿菌工程菌株中N-糖基化修飾外源蛋白質(zhì)，開(kāi)創(chuàng )了利用大腸桿菌 N-糖基化修飾重組蛋白新紀元。近 20 年間，人們利用不同來(lái)源的糖基化轉移酶、寡糖轉移酶，在大腸桿菌中開(kāi)展類(lèi)人源和人源化 N-糖基化重組蛋白、病原菌寡糖的糖疫苗制備研究。

利用大腸桿菌表達系統制備N-糖基化重組蛋白的機制

天然原核生物 N-糖基化修飾系統主要由4個(gè)必要元件組成:糖基化識別序列、糖基轉移酶

(glycosyl transferase，GT) 、糖苷酶、糖底物供體，它們分別負責接受、添加、修剪和提供底物以合成寡糖，并進(jìn)一步通過(guò)依賴(lài)寡糖轉移酶( oligosaccharyl transferase，OST) /非依賴(lài) OST的途徑將寡糖轉移到靶蛋白上。將以上機制轉移到大腸桿菌中，實(shí)現 N-糖基化重組蛋白，可重塑合成寡糖鏈及重組蛋白修飾，將在糖疫苗生產(chǎn)、糖基化修飾藥物蛋白等方面具有巨大應用潛力。

Schematic diagram of the main mechanism of N-glycosylated recombinant protein production via Escherichia coli

A: OST-dependent N-glycosylation system; B: OST-independent N-glycosylation system

應用大腸桿菌表達系統制備N(xiāo)-糖基化重組蛋白

利用大腸桿菌表達系統生產(chǎn)糖基化基因工程抗體等重組蛋白及糖疫苗是目前熱點(diǎn)研究方向。自2012 年Aebi課題組首次利用大腸桿菌實(shí)現類(lèi)人源化糖鏈Man3GlcNAc2核心五糖 N-糖基化修飾重組蛋白后，利用多種原核生物進(jìn)行糖基化修飾的技術(shù)一直在不斷探索中，其技術(shù)核心是將其他原核生物來(lái)源的寡糖轉移酶（識別并將寡糖轉移到重組蛋白上的糖基化識別序列上）和多種糖基轉移酶（非模板驅動(dòng)合成寡糖）在大腸桿菌中共表達，完成寡糖合成及 N-糖基化定點(diǎn)修飾蛋白基本過(guò)程。

近幾年研究結果表明該系統可以實(shí)現定點(diǎn)（識別特異氨基酸序列）、均質(zhì)性（糖鏈微觀(guān)均質(zhì)、糖蛋白宏觀(guān)均質(zhì)）修飾重組蛋白，這是真核系統無(wú)法比擬的優(yōu)勢。真核細胞合成的聚糖性質(zhì)較其他合成途徑而言與人的更為相似（如圖）。但是，天然真核細胞表達系統糖表位修飾N-糖基化重組蛋白的均質(zhì)性很低，這種異質(zhì)性源于哺乳動(dòng)物復合型N-多糖合成的多步驟過(guò)程。

Schematic diagram of antibody glycosylation modification in eukaryotic cells

普健生物擁有十余年的蛋白表達經(jīng)驗，經(jīng)過(guò)不斷的探索和改進(jìn)，開(kāi)發(fā)了建立了3H（High through、High efficiency、High quality）大腸桿菌表達系統，擁有獨特的表達純化及復性平臺，95%以上的超高蛋白表達成功率，已成功交付上萬(wàn)例大腸桿菌表達服務(wù)項目。如果您有大腸桿菌重組蛋白表達與純化項目需求，歡迎聯(lián)系027-87001869與我們的專(zhuān)員進(jìn)行溝通！

Schematic diagram of the production of N-glycosylated recombinant proteins using Escherichia coli

A: Ｒecombinant protein pathway modified by N-glycosylation in Escherichia coli; B: Cell-free glycoprotein synthesis pathway

O-糖基化修飾可以增加治療性蛋白的穩定性和體內循環(huán)時(shí)間。雖然糖基化修飾對每種蛋白質(zhì)的影響可能不同，但研究顯示N-糖基化修飾可通過(guò)以下方式改善蛋白的理化性質(zhì):

①通過(guò)屏蔽非結構化、疏水性或易于蛋白酶作用的蛋白質(zhì)區域來(lái)防止變性、聚集和降解；

②增加分子的分子量和流體動(dòng)力學(xué)半徑以減少腎濾過(guò)；

③去除免疫原性，減少免疫系統清除；

④覆蓋或去除可被人凝集素識別/清除的末端結構。

目前，利用大腸埃希菌解決了均質(zhì)性修飾N-糖基化修飾重組蛋白問(wèn)題。該技術(shù)有望首先在糖疫苗生產(chǎn)方面得到產(chǎn)業(yè)化應用。

參考文獻

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