結核病( tuberculosis，TB) 是由結核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis，MTB )引起的傳染 病。結核分枝桿菌（MTB）俗稱(chēng)結核桿菌（tubercle bacillus），菌細長(cháng)略彎曲，有時(shí)可見(jiàn)分枝，呈單、成堆或成束排列，無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞，有莢膜?？沙霈F多形性，在陳舊的病灶和培養物中，形態(tài)常不典型，可呈顆粒狀，串球狀，短棒狀，長(cháng)絲形等。MTB革蘭染色陽(yáng)性，不產(chǎn)生內外毒素。

Genome of M. tuberculosis

結核分枝桿菌基因組大小為4.4 Mb，基因組G/C含量高達65.6%，預測含4411個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，其中3924個(gè)ORF被認為編碼蛋白質(zhì)，50個(gè)基因編碼穩定的RNA。如由MTB Rv3875基因編碼的早期分泌抗原靶6 kDa蛋白(early secretory antigenic target of 6 kDa, ESAT-6)能誘導強烈的T細胞免疫應答，并提供一定的抗結核免疫保護；Rv3804c基因編碼的Ag85A蛋白是MTB的主要分泌蛋白Ag85復合物成分之一，可使細胞毒性T細胞的細胞毒活力升高；Rv2660c基因編碼的蛋白在MTB處于休眠狀態(tài)時(shí)仍能持續表達，提示Rv2660c基因可作為清除潛伏性感染階段MTB的作用靶點(diǎn)；Rv3428c位于MTB的RD11 區，編碼插入序列IS1532 的轉座酶，可引起體內的細胞與體液免疫，Rv3428c編碼的重組蛋白具有增加γ－干擾素在小鼠中的表達潛力，可作開(kāi)發(fā)結核疫苗的融合抗原。有研究表明Rv3428c重組蛋白有較高的臨床應用價(jià)值，Rv3428c的重組蛋白輔助診斷陰性菌的肺結核有81. 5%靈敏度和82. 0%特異度。

為進(jìn)一步探討Rv3428c在MTB特異性診斷中的研究?jì)r(jià)值，來(lái)自四川大學(xué)華西公共衛生學(xué)院的研究人員通過(guò)同源重組得到pET28a-Rv3428c表達載體，轉入E. coli BL21( DE3)后進(jìn)行IPTG誘導表達，用Ni-NTA親和層析純化目的蛋白。重組蛋白免疫小鼠后進(jìn)行細胞融合，間接ELISA、Western Blot篩選陽(yáng)性雜交瘤細胞系，以篩選獲得的陽(yáng)性雜交瘤細胞誘導小鼠產(chǎn)生腹水，蛋白A親和層析法純化抗體，BCA法測定濃度，ELISA和SDS-PAGE進(jìn)行單克隆抗體的鑒定及亞型和效價(jià)的測定。

Construction and identification of pET28a－Rv3428c vector

普健生物擁有十余年的重組蛋白表達和雜交瘤細胞單克隆抗體制備經(jīng)驗，經(jīng)過(guò)不斷的探索和改進(jìn)，開(kāi)發(fā)了建立了3H（High through、High efficiency、High quality）大腸桿菌表達系統，擁有獨特的表達純化及復性平臺，95%以上的超高蛋白表達成功率，已成功交付上萬(wàn)例大腸桿菌表達服務(wù)項目。如果您有大腸桿菌重組蛋白表達與純化項目需求，歡迎聯(lián)系027-87001869與我們的專(zhuān)員進(jìn)行溝通！此外，普健生物長(cháng)期為國內外科研機構，IVD企業(yè)，抗體藥物企業(yè)提供抗體發(fā)現技術(shù)服務(wù)，積累豐富的抗體開(kāi)發(fā)經(jīng)驗，可以提供DNA免疫，多肽、蛋白免疫，小分子免疫；高通量定制化抗體篩選方案；ELISA、WB、IF、IHC、FC、Biacore 等多樣性高通量檢測平臺以及雜交瘤測序技術(shù)和重組抗體表達服務(wù)。如果您有雜交瘤抗體制備需求或相關(guān)技術(shù)咨詢(xún)，歡迎聯(lián)系027-87001869共同交流探討！

最終測序結果表明，插入序列與MTB H37Rv基因組Rv3428c公布的序列一致，表明原核表達載體構建成功。對重組蛋白進(jìn)行大量表達與純化，純化的重組蛋白使用超濾管進(jìn)行超濾濃縮，SDS－PAGE分析目的蛋白的表達。

Abundantly expression and purification of pET28a－Rv3428c recombinant protein

隨后，通過(guò)Western blot篩選出一株效果好的陽(yáng)性雜交瘤細胞株，通過(guò)體內誘生法制備獲得Rv3428c單克隆抗體。該單抗屬于IgG2a亞類(lèi)，κ型輕鏈，效價(jià)約為1∶128000，濃度為4 mg /ml。

Purification and identification of Anti－Rv3428c Monoclonal Antibody

Determination of purified anti－Rv3428c－mAb titer by ELISA

Identification of monoclonal antibody subtypes by ELISA

Identification of Anti-Rv3428c Monoclonal Antibody Subtypes

關(guān)于MTB診斷抗原的研究有很多，但應用于檢測抗原的研究相對比較空白。Rv3428c特異性地在結核分枝桿菌中表達，其他分枝桿菌中不存在該基因，因此特異性好。這項研究成功構建了MTB的RD11區Rv3428c 表達載體，大量表達并純化蛋白，成功制備Rv3428c單克隆抗體。為后續探索其在臨床樣本中的應用價(jià)值，為臨床MTB快速抗原檢測試劑盒提供參考，為尋找早期、方便快速、靈敏度高、特異性強的診斷方法奠定基礎。

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