酪蛋白是牛乳中含量最多的蛋白質(zhì)，約占牛奶總蛋白質(zhì)的80%。其中，β-酪蛋白約占酪蛋白的30%左右。有研究顯示，由于奶牛的雜交和基因突變等因素的影響，牛乳中β-酪蛋白有多達10余種變異體，其中以A1和A2為比較常見(jiàn)的變異體。

A2β-酪蛋白（A2，β-casein-A2）在消化過(guò)程中不會(huì )像A1β-酪蛋白（A1，β-casein-A1）一樣產(chǎn)生β-酪啡肽-7（BCM-7），而B(niǎo)CM-7可能與過(guò)敏、消化吸收障礙有關(guān)。A1和A2β-酪蛋白區別在于第67位氨基酸的不同，這種分子結構細微的差別，為后期分離和純化帶來(lái)了挑戰，也是市面上還無(wú)商業(yè)化的A1和A2蛋白標準品可供使用的重要原因。來(lái)自乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室的研究人員在實(shí)驗研究中，借助大腸桿菌蛋白表達系統，通過(guò)構建特定β-酪蛋白變異體表達系統，探索了A1和A2β-酪蛋白生物合成的可能性。這也將幫助科研人員為后續乳蛋白定向合成以及相關(guān)乳制品的A1和A2蛋白定量檢測提供基礎。

通過(guò)在Uniprot數據庫中查找β-酪蛋白有224氨基酸序列（P02666），其中在N端包含15個(gè)氨基酸組成的信號肽序列。根據A1和A2蛋白在氨基酸組成上的差異分別得到對應的氨基酸序列設計相應的堿基序列。根據設計對應的堿基序列和相應的帶Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行目的片段的克隆。

通過(guò)Prot Param軟件對A1和A2蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析得到對應蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，A1和A2蛋白分子量在25 kDa左右，親疏水性基本相同。

分別構建含有CSN2-A1和CSN2-A2目的基因的重組質(zhì)粒載體pET28a（+）-CSN2-A1和pET28a（+）-CSN2-A2。將構建的重組表達載體導入到大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導表達和純化。結果表明，在0.2 mmol/L IPTG，37 ℃下誘導表達4 h可獲得大量蛋白，但通過(guò)SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白以包涵體形式表達，存在于細胞破碎后的沉淀中。通過(guò)洗滌、溶解、鎳柱親和色譜純化、復性以及鑒定等步驟最終可獲得純度大于90%（PAGE）的A1和A2重組蛋白。

不同A1/A2重組菌體誘導表達SDS-PAGE考馬斯亮藍染色結果

注：M：Marker；1：未誘導；2~6：誘導后不同單克隆菌株

實(shí)驗結果表明A1和A2包涵體蛋白經(jīng)過(guò)清洗、復溶和純化后在25 kDa附近出現目的蛋白條帶以外基本無(wú)其他雜蛋白，因此達到了預期純化目標。

A1和A2重組表達菌株誘導后得到的沉淀樣、復溶以及純化后樣品SDS-PAGE電泳圖

注：M：Marker；1：破碎后沉淀；2：破碎溶解后上清；3：過(guò)柱流出液；4：清洗樣；5：洗脫樣

包涵體通過(guò)純化后利用透析袋進(jìn)行復性，得到復性后的重組的A1和A2蛋白樣品。SDS-PAGE檢測后呈單一條帶，且純度超過(guò)90%。

A1和A2蛋白作為β-酪蛋白兩種常見(jiàn)的變異體類(lèi)型，由于兩者在分子結構上的細微差異使其在用常規方法制備和純化上存在困難。這項研究最終獲得的A1和A2重組蛋白含量分別為1.5和2.0 mg/mL，這也為人工合成特定變異體的β-酪蛋白提供了新的借鑒。

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